Development of an in vitro stem cell assay for (regulatory) developmental neurotoxicity: a feasability study
Producten
Link: http://www.senc.es/uploads/1158048514__food.doc
Verslagen
Eindverslag
Introductie:
Regulatoire studies waarin chemische stoffen getest worden op hun ontwikkelingsneurotoxische potentie vergen veel tijd en honderden proefdieren. Dergelijke studies, waaronder verplichte dierstudies (meestal met ratten), zijn wettelijk verplicht om kinderen te beschermen tegen ongewenste blootstelling aan mogelijk toxische stoffen in het milieu (geneesmiddelen, voedsel en drinkwater). Effecten van chemische stoffen op neurale ontwikkelingsprocessen zoals proliferatie, migratie, differentiatie of apoptose hebben waarschijnlijk neurotoxische consequenties voor het centraal zenuwstelsel als orgaan. Succesvolle implementatie van een adequate en gevalideerde in vitro methode in first tier screening van chemicaliën (o.a. REACH) en geneesmiddelen als een globale toxiciteitstest op het niveau van de neurale cel leidt uiteindelijk tot een lager aantal stoffen dat getest moet worden in vivo en daarmee tot een reductie in proefdiergebruik. Bestaande in vitro celsystemen voor het testen van neurotoxiciteit staan model voor slechts een deel van de neurale ontwikkeling in vivo. Daardoor zijn deze modellen alleen geschikt om klassen van stoffen te detecteren die specifiek ingrijpen in de in vivo processen die in het in vitro systeem nagebootst worden.
Materiaal en Methoden:
In de voorgestelde in vitro assay voor ontwikkelingsneurotoxiciteit (DNT) worden stamcellen uit muizenembryo’s geforceerd tot differentiatie in de drie belangrijkste celtypen van het centraal zenuwstelsel (neuronen, oligodendrocyten en astrocyten) via processen als proliferatie, migratie en differentiatie, gelijkend op de neurale ontwikkeling die in vivo plaatsvindt. Methylazoxymethanol (MAM) en methylkwik chloride (MeHgCl), bekende ontwikkelingsneurotoxische stoffen, werden gebruikt om de verschillende ontwikkelingsfasen aan te tonen. De uiteindelijke celpopulatie in kweek werd gekarakteriseerd op basis van antigene eigenschappen en gekwantificeerd op basis van morfologische kenmerken volgens stereologische principes.
Resultaten:
MAM remde de proliferatie van cellen in het in vitro model en MeHgCl remde de migratie, beiden zonder de levensvatbaarheid van de cellen aan te tasten. Blootstelling aan MeHgCl tijdens de differentiatiefase veroorzaakte massale cel sterfte. Cellen in de uiteindelijke populatie werden gekleurd met antilichamen tegen zowel rijpe als onvolgroeide cellen. De verdeling van cellen over de verschillende klassen op basis van morfologische kenmerken was gelijk in alle cultures en er was geen duidelijk verschil tussen de variatie binnen en tussen geanalyseerde dekglaasjes met cellen en ook niet in de variatie tussen cultures.
Discussie:
Deze in vitro DNT assay is een veelbelovend alternatief voor in vivo DNT studies in first tier screening, omdat het alle fases omvat van de in vivo ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel inclusief differentiatie tot onvolgroeide en rijpe neurale cellen, de samenstelling van de kweek uit de verschillende celklassen constant is en omdat ontwikkelingsneurotoxische effecten gemeten kunnen worden. Verdere verfijning en validatie is nodig om continuiteit van de cel culture te garanderen.
Introductie
De in vivo ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel (CZS) is een ingewikkeld proces, waarin verschillende processen als proliferatie, migratie en differentiatie een specifieke rol spelen. Beïnvloeding van een van deze, of andere processen zal waarschijnlijk effect hebben op de ontwikkeling van het CZS als orgaansysteem en kan daardoor leiden tot (ontwikkelings-) neurotoxiciteit. Regulatoire neurotoxiciteit studies, in het bijzonder die welke gericht zijn op het zich ontwikkelende zenuwstelsel en waarin nakomelingen van blootgestelde ouderdieren worden bestudeerd, omvatten het testen van grote aantallen dieren. Deze studies zijn complex, duur en tijdrovend. Succesvolle implementatie van een adequate, gevalideerde in vitro methode in ‘first tier’ screening van chemische stoffen voor het testen van toxische effecten op het niveau van de neurale cellen zal uiteindelijk een vermindering opleveren van het aantal stoffen dat alsnog in vivo getest moet worden.
De hypothese is dat de in vitro ontwikkeling van stamcellen tot neurale cellen overeenkomt met de in vivo differentiatie in zoverre dat chemische stoffen die inwerken op de in vivo neuronale ontwikkeling dit ook doen op de neuronale ontwikkeling in het in vitro systeem.
Doel
Het hoofddoel van het onderzoeksprogramma is het ontwikkelen en implementeren van een stabiel en gevalideerd in vitro test systeem waarin ontwikkeling van stamcellen tot een gemengde kweek van neuronen, astrocyten en oligodendrocyten (drie hoofdceltypen in het CZS) plaatsvindt, gedreven door processen als proliferatie, migratie en differentiatie. De belangrijkste vraag is of gekweekte ES-D3 stamcellen verkregen uit de blastocyst van een 129S2-SvPas muis geschikt zijn voor een screeningtest voor ontwikkelingsneurotoxiciteit. Het doel van de projectfase die hier gerapporteerd wordt was het ontwikkelen van een stabiele, reproduceerbare celkweek waarvan we de specifieke details kennen en begrijpen.
Methode
A-specifieke kleuringen en specifieke immuno-kleuringen zijn getest voor het beoordelen en identificeren van celtypen. Drie algemene kleuringen zijn toegepast: hematoxiline-eosine (met en zonder phloxine) en luxol fast bleu kleuring. De celkweken zijn gekarakteriseerd op basis van cel habitus. Kwalificatie van een celkweek vond plaats op basis van morfologische eigenschappen (celvorm en grootte, kern, neuriten, etc). Specifieke antilichamen werden gebruikt voor immuno-kleuring. Er is gekeken of neuronen geidentificeerd konden worden met anti-βIII-tubuline, oligodendrocyten met anti O4 en astrocyten met ‘glial fibrillary acidic protein (GFAP)’. Er is een begin gemaakt met het beschrijven van de kenmerken van de celkweek en de individuele cellen met behulp van stereologische technieken, daarbij gebruik makend van een ‘computer aided stereological toolbox’.
Resultaten
De a-specifieke kleuringen hematoxiline en eosine-phloxine gaven het beste contrast. Neuronen zijn met succes gekleurd met anti-βIII-tubuline en oligodendrocyten met anti O4, maar de methode behoeft wel verbetering. We zijn er (nog) niet in geslaagd astrocyten te identificeren met behulp van anti-GFAP.
Tot nu toe zijn de resultaten van de celkweek nog niet bevredigend. Er is teveel variatie. We weten dat cel aantal en confluentie belangrijke factoren zijn in het verkrijgen van een goede kweek, maar we hebben dit aspect nog niet voldoende in de hand.
Conclusie
Samenvattend kan worden gesteld dat, ofschoon er nog geen stabiele en reproduceerbare kweek kan worden gegarandeerd, deze studie zeker heeft bijgedragen tot aanzienlijk beter inzicht in een aantal relevante aspecten die bijdragen aan het uiteindelijke keekresultaat. Bovendien is beter inzicht verkregen in de verschillende cel typen die in de kweek voorkomen en is een goede beschrijving van de cellen en hun onderlinge relaties gemaakt. Daarenboven zijn de cellen selectief, deels succesvol, aangekleurd met specifieke immunokleuringen.
Uit de resultaten is gecon