Nucleotide excision repair in vivo: a paradigm for chromatin-associated processes

DNA wordt voortdurend beschadigd door omgevingsfactoren, zoals UV-straling en chemische producten. DNA schades verstoren gentranscriptie en de replicatie van het genoom, waardoor het functioneren van cellen ernstig verstoord kan worden. DNA schades veroorzaken o.a. mutaties in groeiregulerende genen, dit kan leiden tot ongecontroleerde groei en kanker. Er zijn verschillende reparatiemechanismen om DNA schade te verwijderen, waaronder nucleotide excisie reparatie (NER). NER repareert verschillende soorten DNA schades, zoals die door UV-straling veroorzaakt. Aangeboren afwijkingen in NER genen veroorzaken de zeldzame ziekte Xeroderma Pigmentosum. Patiënten zijn extreem zonlicht gevoelig en vertonen een 1000 maal verhoogd risico op huidkanker. Dit laat het belang van een functioneel NER zien en het belang om een volledig inzicht te verkrijgen in het moleculaire mechanisme van NER. Ondanks gedetailleerde biochemische kennis van NER-enzymen, is er echter nog weinig bekend over NER in vivo. Binnen een voorafgaand project zijn procedures ontwikkeld om NER-eiwitten te bestuderen in intacte cellen, m.b.v immuno-kleuring in combinatie met een in dat project ontwikkelde procedure om lokaal in kernen van cellen UV-schade te induceren. Vervolgens, is er een procedure ontwikkeld om de beweging van NER-eiwitten in levende cellen te vervolgen. Aan NER-eiwitten wordt (m.b.v. genetische methoden) het groen fluorescente proteïne (GFP) gekoppeld en met behulp van moderne hoge resolutiemicroscopen kan de enzymatische activiteit van deze NER-enzymen in levende cellen worden gemeten. Deze methodiek heeft tot revolutionaire nieuwe celbiologische inzichten geleid over de werking van complexe enzym systemen in levende cellen. Het doel van dit project is: (1) inzicht verkrijgen in de werking, kinetiek, en spatiële organisatie van NER in levende zoogdier cellen. (2) inzicht te verkrijgen in de dynamische interacties tussen NER en transcriptie, replicatie and andere reparatie processen. (3) de invloed van chromatine structuur op NER en vise versa. (4) een alles omvattend computer model van NER genereren. Resultaten: Om deze doelen te bereiken hebben we: (a) Een collectie van cellijnen (huidfibroblasten) gemaakt die belangrijkste NER-eiwitten, veertien in totaal, gemarkeerd met GFP tot expressie brengen. De cellijnen zijn geselecteerd op biologisch activiteit en expressie op fysiologisch niveau van de GFP-NER eiwitten. Dit panel is uiterst waardevol gebleken bij de systematisch analyse van de dynamische interacties van NER eiwitten met DNA schade in vivo en heeft geleid tot een groot aantal publicaties, waarbij inzicht is verkregen in spatio-temporele organisatie van NER (Essers, 2005b; Giglia-Mari, 2006; Zotter, 2006; Luijsterburg, 2007; Hoogstraten, 2008; Alekseev, 2008; Sabbioneda, 2008). (b) Een procedure ontwikkeld om gedurende langere tijd (tot 24 hr.) de lokalisatie van een DNA herstel eiwit te vervolgen (Essers, 2005b). Dit onderzoek heeft verder een verassende conservering van chromosoom posities in de kern na celdeling aan het licht gebracht. (c) Bestaande procedures om lokaal in de kern van cellen DNA te beschadigen systematisch met elkaar vergeleken (Williams, 2007; Dinant, 2007). En hebben een nieuwe microscoop opstelling ontwikkeld om lokaal (in kernen) met een UV-C laser specifiek foto-laesies te maken (Dinant, 2007). Deze ontwikkeling is van groot belang gebleken voor de verdere analyse van NER eiwitten. (d) Een verbeterde FRET procedure ontwikkelt om in vivo eiwit-eiwit interacties te kunnen meten (Dinant, 2008b), welke in vervolg onderzoek goed toepasbaar zal zijn. (e) Een aangepaste procedure ontwikkelt om m.b.v. chromatine immuno-precipitatie (ChIP) om chromatine gebonden actieve NER-eiwit complexen te analyseren (Fousteri, 2006) en heeft geresulteerd in een sterk verbeterd inzicht in de rekrutering van reparatie en chromatine-modulerende ezymen naar transcriptie-gekoppeld reparatie complexen. Bovendien heeft dit tot vernieuwd inzic