High throughput and comprehensive resequencing of cardiomyopathy genes by CHIP based DNA-sequencing technology (CardioCHIP)
De CardioCHIP is een snelle, betrouwbare en goedkope methode om de genetische oorzaak van erfelijke afwijkingen aan de hartspier (cardiomyopathieën) op te sporen. Dit blijkt uit onderzoek uit het MUMC+.
Het is voor patiënten en hun familieleden wezenlijk om de oorzaak ervan te kennen, voor behandeling en preventie. De conventionele manier voor dit genetisch onderzoek is opsporing van eventuele afwijkingen (mutaties) in betrokken genen door de volgorde van bouwstenen in het DNA te bepalen. Deze zogeheten sequentie-analyse is echter tijdrovend en kostbaar, waardoor in de klinische praktijk slechts een deel van de mogelijke genen kan worden onderzocht. De CardioCHIP bepaalt gelijktijdig de mutaties in 34 genen en blijkt 22 keer sneller en 12 keer goedkoper zonder dat mutaties worden gemist. De onderzoekers willen een professionele database ontwikkelen die toegankelijk is via het internet. Op deze manier wordt de dataset, die uniek is om het aantal genen en patiënten, wereldwijd beschikbaar voor verder wetenschappelijk onderzoek en patiëntenzorg.
Verslagen
Eindverslag
Erfelijke cardiomyopathieën zijn frequente, vaak fatale hartspieraandoeningen met een voorkomen van 1 op 500 (hypertrofische cardiomyopathie of HCM) tot in 1 in 2500 (gedilateerde cardiomyopathie of DCM). Door het grote aantal genen dat deze aandoeningen kan veroorzaken, de heterogeniteit van de klinische expressie en de tijdrovende laboratoriumonderzoeken is het moeilijk om in elke patiënt snel de genetische oorzaak te achterhalen. De huidige diagnostische protocollen lossen ongeveer 60% van de families op door een beperkt aantal genen na elkaar te testen, wat een zeer tijdrovend proces is. Meestal stopt men ook als een pathogene mutatie is gevonden. Het wordt echter steeds duidelijker dat meer dan 1 mutatie kan voorkomen en dit is al gerapporteerd voor 5-10% van de families. Daarom hebben wij een CardioCHIP ontwikkeld, waarmee snel en gelijktijdig 34 genen op mutaties kunnen worden onderzocht in patiënten met cardiomyopathie. Op deze CHIP staan alle genen, waarvan bekend is dat deze gemuteerd kunnen zijn bij erfelijke cardiomyopathieën, en een aantal kandidaatgenen op basis van hun rol in de hartspier (sarcomeer- en Z-disc-eiwitten). Alle exonen en een deel van de flankerende intronen van hart- en spierspecifieke isovormen zijn op de CHIP aangebracht. Ook de 5’ en 3’ UTR’s en een deel van de promoter-regio’s staan erop. De genen, die getest worden met de CardioCHIP, worden geamplificeerd met behulp van 152 long-range PCR-reacties, die 395 exonen omvatten en 146.541 nucleotiden per patiënt opleveren. In totaal zijn 256 patiënten met de CardioCHIP voor alle genen onderzocht. Ongeveer 125.000 varianten zijn gevonden in het hele cohort, wat ongeveer 488 varianten per patiënt betekent. Van de bekende mutaties wordt 99% opgepikt en van de nieuwe met de CardioCHIP gevonden mutaties wordt 98% bevestigd met conventionele sequentieanalyse. De gevonden varianten zijn opgeschoond voor bekende polymorfismen en waarschijnlijk neutrale varianten, waardoor een aantal van 540 varianten overblijft die pathogeen zijn of waarschijnlijk pathogeen, zgn unclassified variants (UVs). Dit laatste is gebaseerd op genetische en functionele pathogeniciteitscriteria. Een pathogene mutatie of UV is gevonden in circa 80% van de patiënten, in 20% is geen mutatie aangetoond. Ongeveer de helft van de eerste groep patiënten heeft meer dan 1 mutatie of UV in een van de genen en een beperkt aantal zelf 5 of meer. Dit geeft aan dat meerdere mutaties of UVs per individu veel vaker voorkomen dan oorspronkelijk gedacht en dat verschillende mutaties en ziektebeelden in de familie van dergelijke patiënten kunnen segregeren. Voor een accurate prognose en om misinterpretaties te voorkomen is het wezenlijk alle genen te testen in alle patiënten en niet alleen voort te borduren op het eerste geïdentificeerde defect, zoals op dit moment gebeurt. Ongeveer 44% van alle mutaties wordt gevonden in 2 genen, maar de rest (36%) is versnipperd over 31 genen, wat aangeeft dat elk van deze genen verantwoordelijk is voor slechts een klein deel ervan en dat gelijktijdige analyse van alle genen noodzakelijk is om deze defecten snel op te kunnen sporen. De CardioCHIP is ongeveer 22 keer sneller en 12 keer goedkoper dan conventionele sequentieanalyse. Onze data tonen aan dat de CardioCHIP een snelle, betrouwbare en goedkope methode is om veel genen tegelijkertijd op mutaties te onderzoeken. Dit is een absolute voorwaarde voor genetisch heterogene aandoeningen, zoals erfelijke cardiomyopathieën, om snel en volledig alle genetische oorzaken in patiënten en verwanten met een genetisch risico te kunnen bepalen, waarmee accurate prognoses en verantwoorde preventieve behandelingen mogelijk en gelegitimeerd worden.
Cardiovasculaire aandoeningen vormen doodsoorzaak nummer 1 in de Westerse wereld. Elf procent komt door hartfalen, gedeeltelijk veroorzaakt door erfelijke cardiomyopathie. Genetisch onderzoek is niet eenvoudig, omdat een specifieke relatie tussen kliniek en gendefect ontbreekt en additionele mutaties de manifestatie van het primaire genetische defect beïnvloeden. Snelle diagnostiek, identificatie van individuen met een genetisch risico en actuele prognose op basis van alle gendefecten zijn wezenlijk voor deze potentieel fatale aandoeningen en de rechtvaardiging van agressieve behandelingsmethoden. Daarom zetten wij een een nieuw CHIPs-platform op om snel en compleet 34 kandidaatgenen te testen op mutaties. Dit project vormt een eerste stap naar individuele gezondheidszorg op basis van genetische constitutie.
In totaal zijn 34 genen geselecteerd voor de Cardio-CHIP (ACTC, ACTN2, CAPN3, CSRP3, DES, DTNA, GLA, JPH2, LAMP2, LDB3, LMNA, MYBPC3, MYH7, MYL2, MYL3, MYL7, MYOT, MYOZ1, MYOZ2, MYPN, PLN, PRKAG2, TAZ, TCAP, TMOD1, TMPO, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1, TRIM63, VCL, CAV3, PDLIM3) op basis van gepubliceerde mutaties in deze genen en/of functionele overeenkomsten, m.n. wat betreft het sarcomeer en cytoskelet. Van deze genen worden alle coderende, niet-coderende en alternatieve exonen en 38bp van het intron op de CHIP gezet en van 8 genen ook nog 500bp promotersequentie. Twee MYBPC3 founder-mutaties zijn eveneens toegevoegd. Alle sequenties zij vrij gemaakt van repeats en staan in duplo op de CHIP om de “call-rate” te verhogen.
In totaal zijn 149 long-range PCRs geoptimaliseerd om de genen op de Cardio-CHIP te onderzoeken. Het PCR Extender systeem (5Prime) en de Advantage GC Genomic LA polymerase mix (Clontech) zijn geselecteerd op basis van prestaties en prijs. Wij hebben 2 protocllen ontwikkeld, die als back-up van elkaar kunnen dienen. Alle protocollen werken onder dezelfde condities, waarmee opschaling en automatisering mogelijk wordt, zodat 47 monsters in 1 keer kunnen worden getest. De protocollen werken ook op DNA dat geamplificeerd is via “whole genome amplification” (Repli-g mini). Dit is m.n. van belang omdat voor de long-range PCR 3800ng DNA nodig is per patiënt. Voor whole genome amplification is slechts 10ng nodig. Dit speelt een rol in geval een patiënt overleden is en de hoeveelheid DNA eindig is. Omdat long-range PCR duur is hebben wij de kosten gereduceerd door de hoeveelheid reactiemix en enzym te verminderen zonder de prestaties aan te tasten. Slechts 8 reacties zijn nog niet helemaal optimaal, maar dit betreft slechts een paar GC-rijke exonen. Deze zullen buiten de eerste experimenten worden gelaten en worden later in het project verder geoptimaliseerd.
Een technische test van de resequencing CHIPs is uitgevoerd op een kleinere DCM-CHIP met 11 genen, die wij van onze partner (S. Waldmüller, Dortmund) hebben gekregen. In totaal 14 CHIPs zijn getest met onze long-range producten en vergeleken met conventionele sequentieanalyse. De gemiddelde “call-rate” is 92,06% en de op basis van conventionele sequencing bekende mutaties en SNP's werden gedetecteerd m.b.v. de CHIP.
Alle 250 te testen patiënten zijn geselecteerd uit onze biobank. Tot dusver zijn slechts 4 Cardio-CHIPs in duplo gerund under 2 scanning-condities. Er is voor 2 condities gekozen om ook kwantitatieve verschillen te kunnen oppikken t.g.v. niet-hybrisieren van de probe in geval van deleties of inserties. De gemiddelde “call rate” is 91,46%, maar dit kan verbeterd worden door de software settings aan te passen en meer CHIPs te runnen als vergelijking. Momenteel zijn wij bezig met de data-analyse en de vergelijking met de conventionele sequenties. Een database is gemaakt voor elk van de 34 genen om de enorme hoeveelheid data efficiënt te kunnen hanteren.
Het project is gepresenteerd in locale meetings in Maastricht en nationaal in ICIN-verband. Een lezing "The pros and cons of resequencing CHIPs for the diagnosis of inherited cardiomyopathies" is ge