Identificeren en valideren van transcriptomics biomarkers voor toxicologische screening van stoffen; ontwikkeling van een ToxIDChip.
Producten
Auteur: Jonker MJ, Bruning O, van Iterson M, Schaap MM, van der Hoeven TV, Vrieling H, Beems RB, de Vries A, van Steeg H, Breit TM, Luijten M.
Auteur: Bruins W, Jonker W, Bruning O, Pennings J, Schaap M, Hoogervorst E, Speksnijder E, van Steeg H, Breit TM, de Vries A
Magazine: Carcinogenesis
Auteur: Baken KA, Pennings JLA, Breit TM, de Vries A, van Steeg H, van Loveren H
Magazine: Journal of Immunotoxicology
Auteur: Baken KA, Pennings JLA, Jonker MJ, Schaap MM, de Vries A, van Steeg H, Breit TM, van Loveren H
Magazine: Toxicology and Applied Pharmacology
Verslagen
Eindverslag
Inleiding: Om kankerverwekkende eigenschappen van stoffen te bepalen wordt nog steeds uitsluitend de chronische bioassay gebruikt welke onacceptabel grote aantallen proefdieren vereist en een zeer welzijnbelastende karakter heeft. Er zijn transgene muismodellen beschikbaar die betrouwbare voorspellingen voor kankerverwekkende eigenschappen van stoffen kunnen doen met aanzienlijk minder proefdieren en veel korter tijdsbestek. De microarray technologie, in het kader van toxicogenomics, zou een verdere 3V's verbeteringen kunnen maken. De projectdoelstelling was het ontdekken van transcriptomics biomarkers (i.e. sets van genen plus bijbehorend expressieprofiel), waarmee (klassen) van kankerverwekkende stoffen kunnen worden herkend. Vooral, wel en niet kankerverwekkende stoffen, en een verder specificering van kankerverwekkende stoffen die wel en geen DNA schade veroorzaken. Het uitgangspunt was dat er voor iedere stofklasse een biomarker te vinden moet zijn voor het target weefsel en mogelijk ook voor surrogaat weefsels, omdat kankerverwekkende stoffen in het algemeen basale cellulaire responsmechanismen initiëren. Alle biomarkers bij elkaar zouden een ToxIDChip kunnen vormen, die te gebruiken is bij het bepalen van de kankerverwekkende eigenschappen van een nieuwe stof (i.e. het classificeren). Dit project beoogde het 'proof-of-principle' van een ToxIDChip. Binnen dit project lag de nadruk op het identificeren van biomarkers met behulp van statistiek bioinformatica en het testen met een aantal bekende (niet) kankerverwekkende stoffen. De disseminatie zou de aanzet kunnen zijn van een solide validatie door middel van een publiekprivate samenwerking van het ontwikkelen van bruikbare biomarkers. Materiaal: Genotypes: wild-type (WT) en XPA-/-/p53+/- (XPA/p53). Weefsels: Lever, milt, blaas, mesentheliale lymfklier (MLN), en perifeer bloed. Stoffen: Genotoxisch carcinogeen (GTXC) 2-AAF en B[a]P; Niet-genotoxisch carcinogeen (NGTXC) CsA en WY14,643 (WY); Controles, niet carcinogeen (NC) TBTO en onbehandeld. Behandeling: 3, 7, 14, 28 dagen blootstelling. Replica’s: 8 muizen, 2x4 RNA pools van 2 muizen. Microarrays: 464 met 8.205 informatieve probes (≈ genen). Bioinformatica methoden: Genexpressie analyse: ANOVA. Biomarker identificatie: Nearest Centroïd (NC) classificatie methode; Support vector machine (SVM) classificatie methode; Diagonal linear dicriminant analysis (DLDA) methode; in combinatie met 3-klasse en 2-staps aanpak. Resultaten: De eindpunten van de chronische bioassay, histopathologische veranderingen na 28 dagen, en genexpressie profielen na kortdurende blootstellingen zijn niet eenduidig met elkaar te verbinden. Er is veel moeite gestoken in het vinden van de juiste combinatie van methode en aanpak. Afhankelijk van de fout per classificatie methode, is uiteindelijk gekozen voor de DLDA methode met de 3-klasse en 2-staps aanpak. De hele strategie bestaat uit: bepalen van de grootte van de te analyseren gen set, gensets identificeren met 10x tienvoudige crossvalidatie, samenstellen van een biomarker uit die gensets, het onderscheidend vermogen van de biomarker testen met PCA en crossvalidatie. Voor alle weefsel-stofklasse-genotype combinaties zijn biomarkers geïdentificeerd die een redelijke tot zeer goede voorspellende waarde hebben. Hiermee is het proof-of-principle van de ToxIDChip geleverd. Als extra is aangetoond dat bloed waarschijnlijk kan dienen als surrogaat weefsel voor short-term toxicogenomics. Discussie: Vanwege het incomplete experimentopzet, zijn de conclusies voornamelijk op lever en milt analyses gebaseerd. Het aantal genen met differentiële expressie verschilt sterk ten gevolg van de gebruikte dosis. Dit bepaald in hoge mate het succes van biomarker identificatie, dosis range-finding voor de toxicogenomics aanpak is dan ook noodzakelijk. De voorspellende waarde van de biomarker is ook afhankelijk van de methode-aanpak combinatie. Helaas in er geen standaard toepasbare optimale combinatie. De uitkomste
We zijn begonnen om stap 4 van het plan van aanpak Extractie en opslag microarray data opnieuw uit te voeren. Er is een uitgebreide kwaliteitscontrole op de array data uitgevoerd. Vervolgens zijn we verder gegaan met stappen 5 en 6 van het plan van aanpak: Solide statistische validatie van geëxtraheerde micro-array data en Biomarker identificatie door middel van bioinformatica analyse van tumor-targetweefsel. Hiervoor hebben wij een driestaps aanpak gekozen:
1. een naïeve aanpak gebaseerd op alleen een minimaal genexpressie level in combinatie met een fold-change tussen onbehandeld en behandeld (>2)
2. een meer statistisch onderbouwde aanpak uitgaande van significante veranderingen tussen onbehandeld en behandeld met voldoende permutaties. (False Discovery Rate =5%).
3. een statistische methoden die uitgaat van biomarker gensets ipv individuele biomarker genen.
De 1e aanpak is al uitgevoerd (zie resultaten). De 2e aanpak is voor 3 tissues reeds uitgevoerd en wordt momenteel uitgerekend voorvoor het laatste tissue. Voor de 3e aanpak zijn de statistische methoden reeds geëvalueerd en gekozen.
Hier tussendoor zijn delen van deze dataset reeds gebruikt om stap 9 van het plan van aanpak Mechanistische context genereren voor de gevonden biomarkers gedeeltelijk uit te voeren. Dit is samenwerking gegaan met andere RIVM projecten. Hiervoor zijn statische analyses uitgevoerd met name op de onbehandelde, TBTO lever set in combinatie met additionele data van het RIVM. Dit heeft inzichten opgeleverd in de het werkingsmechanisme van blootstelling van de lever aan TBTO. Deze analyses hebben geleid tot een publicatie in een peer-reviewed tijdschrift (zie resultaten).
In eenzelfde constructie is ook gekeken naar de data van onbehandeld, TBTO, CsA en B[a]P in de milt. Ook dit heeft veel inzichten opgeleverd in de het werkingsmechanisme van blootstelling van de milt aan deze schadelijke stoffen. Deze analyses hebben ook geleid tot een publicatie in een peer-reviewed tijdschrift (zie resultaten).