Multi-photon excitation microscopy and fluorescence life-time imaging for drug research.

Investering door NWO: Er is een opstelling gebouwd geschikt voor verscheidene high-end fluorescentie microscopie toepassingen. De opstelling voor multi-photon confocal laser scan microscopie (MP-CLSM) bestaat uit een Bio-Rad Radiance CLSM, geschikt voor muticolor opnames van specimen gelabeld met maximaal 4 fluorescerende probes. Daaraan gekoppeld een Spectra-Physics Tsunami pulse laser geschjkt voor het genereren van ultrakorte (12 ns) pulsen licht met een golflengte tussen 700-900 nm. Het geheel is gebouwd rond een omgekeerde Nikon TE2000U en een rechtopstaande E600FN microscoop. Tevens is een Nikon life-time module (LIMO) gekoppeld waarmee de levensduur van het emissielicht kan worden gemeten. Daarnaast is een Roper Scientific camera-based spectrograaf aangebouwd waarmee de golflengte van het emissielicht wordt bepaald, eveneens voor bepaling van FRET.
Investeringen door de sectie Toxicologie: de opbouw en operabel maken van het systeem heeft ca 1 jr fte gekost. Er is een AIO, Drs. LeDévédec, speciaal aangesteld om de diverse technieken te implementeren. Daarvoor heeft zij intensief samengewerkt met verschillende groepen in het land. De sectie heeft geïnvesteerd in een kast voor klimaatbeheersing CO2/T anesthesieapparatuur, imaging software. Een NWP, Dhr. De Bont, heeft het beheer en instructie in zijn takenpakket
Businessplan: Teneinde continuïteit en onderhoud te waarborgen is een businessplan opgesteld. Er wordt een bedrag gevraagd voor het gebruik van de apparatuur. Zodoende wordt een reserve gekweekt waaruit het onderhoud betaald kan worden.
Technieken: Technieken die toegepast kunnen worden zijn intravital imaging; Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP); Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET); Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
Gebruikers. Gebruikers komen van binnen het LACDR, vanuit het Leids Instituut voor Chemie (LIC) en vanuit het Leids Universitair Medisch Centrum (LUMC). Vanuit deze instituten zijn er vier belangrijke research lijnen die gebruik maken van het confocale systeem: tumor cel biologie, mechanismen van cytotoxiciteit, geneesmiddel transport en neuronale signaal transductie
Toepassing MP-CLSM in geneesmiddelonderzoek. MP-CLSM heeft vijf grote voordelen: de hoge intensiteit van de laser maakt FRAP experimenten mogelijk; het gepulste licht maakt FLIM experimenten mogelijk; het rode licht van de multi photon laser dringt diep in weefsels, processen die zich afspelen tot aan een diepte van 200 μm kunnen bestudeerd worden; doordat er alleen excitatie in het focale vlak plaatsvindt is directe detectie mogelijk, er hoeft dus niet gebruik gemaakt te worden van een pinhole; two-photon excitatie maakt het mogelijk om probes te gebruiken waarvoor anders een UV-laser nodig zou zijn.
Een aantal voorbeelden van toepassingen zijn: 1) intravital imaging van tumor celmigratie in de intacte tumor in het levende dier (2-photon/live cell/3D); 2) time-lapse ‘live cell’ 3-D three-color visualisatie van de interactie tussen Natural Killer (NK) cellen en tumor cellen (2-photon/live cell/3D); 3) cytoskelet dynamiek in relatie tot cellulaire stress (live cell/multicolour/FRAP); 4); de dynamiek en interactie van focal adhesie geassocieerde eiwitten in tumor cellen en niercellen in relatie tot cel migratie en cellulaire stress (live cell/FRAP/FRET/FLIM); 5) transport van geneesmiddelen door de humane huid (2-photon/3D). Een gedetailleerde beschrijving van de verschillende deelprojecten wordt later beschreven in het verslag. Films van experimenten met levende cellen en proefdieren kunnen bekeken worden op de website www.toxicology.leidenuniv.nl onder 'Visualization Core Facilities'.