Regulation of gene expression during hypoxia

Het uiteindelijke doel van dit voorstel was het onderzoeken van nieuwe cellulaire adaptaties die geactiveerd worden wanneer zuurstof zeer beperkt is. Deze reacties op hypoxia zijn belangrijke graadmeters van het gedrag van de tumor en de efficientie van behandeling. Onze focus was gericht op het begrijpen van deze adaptaties en hoe deze nieuwe signaleringsroutes geactiveerd worden om zo hun rol in tumor cell biologie te bepalen.

Ten Tijde van indiening van dit voorstel hadden we de nieuwe ontdekking gedaan dat de hypoxie-condities, waargenomen in humane tumoren, nieuwe eiwitaanmaak inhiberen middels het remmen van mRNA-translatie. Gebaseerd hierop hebben we 3 doelen voor dit project gesteld:

1) Definieer de signaleringsroutes die initiatie van translatie reguleren tijdens acute en chronische hypoxie.

Onze doelen waren het begrijpen van de mechanismen die tot mRNA-translatie-inhibitie tijdens hypoxie leiden. We wilden weten of hypoxia de “unfolded protein response (UPR)” activeerde en het belang van PERK kinase en zijn target eIF2alpha in dit mechanisme. Ook is voorgesteld om de rol van het mRNA cap-bindende complex eIF4F te bepalen, middels knockdown experimenten van haar componenten.

2) Bepaling van de impact van translatie regulering tijdens hypoxia op cel fenotype en gen expressie.

Dit doel omhelst het grootste deel van de subsidie waarin we hebben voorgesteld om de biologische relevantie van de signaleringsroutes die mRNA translatie reguleren tijdens hypoxie. Hierin hebben we de rol van zowel PERK/eIF2alpha, als eIF4F op gen-expressie en hypoxie-tolerantie tijdens acute en chronische hypoxie bepaald. Het belang van deze routes op hypoxie-tolerantie zou bepaald worden zowel in vitro als in in vivo tumor modellen. Het belang van veranderingen in globale mRNA translatie-snelheid op individuele gen-expressie was onderzocht mbv microarray analyse van polysomaal mRNA en middels proteomics technieken.

3) Het bepalen van de moleculaire mechanismen voor gen-specifieke mRNA translatie tijdens hypoxie.

Het doel hiervan was het identificeren van elementen die selectieve mRNA translatie tijdens hypoxische condities mogelijk maken, door signalering via PERK/eIF2alpha of eIF4F. Dit werd gedaan door analyze van de UTRs van selectief gereguleerde genen, de translatie van specifieke hypoxie-induceerbare genen en het belang van IRES-gemedieerde translatie.

Tijdens dit project hebben we veel kennis opgedaan over onze initiele ontdekking en, mbv NWO, hebben we in totaal 25 publicaties sinds 2003 op dit onderwerp gepubliceerd. Een van de opvallendste ontdekkingen omvat het aantonen dat hypoxia een proces activeerd, dat bekend staat als de “unfolded protein response (UPR)” en dat dit proces belangrijk is voor tumor-groei. Gebruik makend van een varieteit aan tumor-modellen afkomstig van genetisch-gemodificeerde muizen en humane tumor cell lijnen die we genetisch dusdanig gemodificeerd hebben dat activatie van deze pathways geblokeerd is, zijn we in staat geweest aan te tonen dat de UPR verantwoordelijk is voor een snelle blokkering eiwit-productie tijdens hypoxie. Deze blokkering beinvloedt ook de specifieke eiwit-expressie en is daarom een belangrijke regulator van gen-expressie tijdens hypoxie. Gebruik makend van genomische middelen, zoals microarray en proteomics, hebben we een aantal genen geidentificeerd en routes die gereguleerd worden door de UPR tijdens hypoxie. We hebben ook aangetoond dat deze routes belangrijk zijn voor hypoxie-tolerantie en tumor groei, deze zijn daarom mogelijk interessante doelen voor therapie.